Metabolizm metoprololu: 22 metabolity i rola CYP2D6 w praktyce

Metoprolol należy do grupy β-blokerów szeroko stosowanych w kardiologii, jednak jego pełna charakterystyka metaboliczna jako leku o niskim klirensie pozostawała dotąd niewystarczająco poznana. Mimo że lek ten od lat służy jako probier fenotypowy enzymu CYP2D6 i modelowy związek o wysokiej biodostępności doustnej, szczegółowe dane dotyczące jego wątrobowych szlaków eliminacji są fragmentaryczne. Dotychczasowe badania identyfikacji metabolitów prowadzono w różnych matrycach – osoczu szczurzym, mikrosomach wątrobowych człowieka, osoczu i moczu ludzkim oraz osoczu psim – lecz zazwyczaj opisywały jedynie metabolity drugorzędowe, co wynikało z dominującej roli wydalania nerkowego i krótkotrwałych warunków inkubacji in vitro.

Nowe badanie podstawowe, opublikowane w czasopiśmie ADMET and DMPK, wypełnia tę lukę wiedzy poprzez systematyczną charakteryzację metabolizmu metoprololu z wykorzystaniem plateable hepatocytów w długotrwałych hodowlach oraz enzymów rekombinowanych. Zespół badawczy zastosował hepatocyty od szczurów (10 dawców), psów, małp i człowieka (po 1 dawcy każdego gatunku), inkubując je przez okres do 72 godzin. Głównym celem było określenie profilu metabolicznego leku, identyfikacja nowych metabolitów oraz ocena potencjalnych działań hepatotoksycznych w kontekście międzygatunkowym.

Jak niski jest klirens metoprololu i dlaczego ma to znaczenie?

Badania stabilności metabolicznej wykazały, że metoprolol charakteryzuje się typowymi cechami związku o niskim klirensie. W plateable hepatocytach ludzkich klirens wewnętrzny in vitro (CL_int) wyniósł 0,56±0,12 μL/min na milion komórek, co po ekstrapolacji dało wartość klirensu in vivo na poziomie 1,59±0,31 mL/min/kg. Wartości te plasują się znacznie poniżej progu 10 mL/min/kg definiującego leki o niskim klirensie i są zgodne z wcześniejszymi doniesieniami wskazującymi na klirens rzędu 2,2±0,7 μL/min/milion komórek oraz in vivo 1,4 mL/min/kg.

Kluczowym odkryciem było potwierdzenie wyłącznej roli enzymu CYP2D6 w metabolizmie metoprololu. Spośród testowanych izoform cytochromu P450 (CYP1A2, 2C9, 2C19, 3A4, 2B6 i 2C8) jedynie CYP2D6 wykazał istotną aktywność metaboliczną, odpowiadając za 100% obserwowanego klirensu z szybkością 5,46 μL/min na pmol białka. Ta niezwykła selektywność podkreśla kluczowe implikacje kliniczne – u pacjentów będących tzw. słabymi metabolizerami CYP2D6 (osoby z obniżoną aktywnością tego enzymu) może dochodzić do kumulacji leku i zwiększonego ryzyka działań niepożądanych.

Jakie nowe metabolity metoprololu zostały odkryte?

Przy użyciu spektrometrii mas wysokiej rozdzielczości (LC-HRMS) zespół zidentyfikował łącznie 22 metabolity metoprololu, z czego 15 jest nowych i wcześniej nieopisanych. Metabolity te eluowały w zakresie czasów retencji od 2,64 do 13,52 min, wykazując efektywną separację chromatograficzną. Sama substancja macierzysta (metoprolol) była wykrywana jako zprotonowany jon molekularny przy m/z 268,1914, z charakterystycznymi jonami fragmentacyjnymi.

Do najważniejszych zidentyfikowanych metabolitów należą:

• M10 – produkt mono-oksygenacji (m/z 284,1863), dominujący u szczurów (24,4% całkowitej masy) i istotny u ludzi (20,1% w enzymach rekombinowanych CYP2D6)
• M13 – produkt O-demetylacji (m/z 254,1755), stanowiący główny metabolit u psów (20,5%) oraz istotny u ludzi (22,8% w CYP2D6)
• M17 – produkt utleniania identyfikowany jako kwas metoprololowy (m/z 268,1551), dominujący u małp (82,6%) i ludzi (14,6%)
• M7 i M14 – addukty glutationowe (m/z 295,1287 przy z=2), wykryte bezpośrednio w hepatocytach szczurzych i ludzkich, sugerujące potencjalną reaktywność metaboliczną

Główne szlaki biotransformacji obejmowały mono-oksygenację, O-demetylację oraz utlenianie, z CYP2D6 jako kluczowym enzymem pośredniczącym w tych reakcjach. Szczególnie interesujące było wykrycie metabolitów glukuronidowanych (M6, M11, M12, M15, M19-M22) oraz związków glutationu, co wskazuje na aktywację szlaków detoksykacyjnych fazy II.

Czy profil metaboliczny różni się między gatunkami?

Badanie wykazało znaczące różnice międzygatunkowe w profilu metabolitów metoprololu. U szczurów dominowały metabolity M10 (24,4%) i M17 (57,2%), podczas gdy u psów główne były M13 (20,5%) i M17 (19,9%). U małp i ludzi przeważał metabolit M17, odpowiednio 82,6% i 14,6% całkowitej abundancji masowej.

Kluczowym odkryciem było to, że M10 wykazywał tendencję do dalszej biotransformacji w addukty glutationowe u szczurów, co sugeruje potencjalną toksyczność związaną z tworzeniem reaktywnych metabolitów. Rola metabolizmu zależnego od CYP w tym szlaku toksycznym została potwierdzona przez nieodwracalną inhibicję z użyciem 1-aminobenzotriazolu (ABT) – niespecyficznego inhibitora cytochromu P450. Preinkubacja z ABT znacząco zwiększyła żywotność hepatocytów szczurzych i odwróciła działanie cytotoksyczne przy stężeniu 500 μM metoprololu.

Co istotne, hepatocyty ludzkie wykazały większą odporność na cytotoksyczność wywołaną metoprololem. W zakresie testowanych stężeń (0-500 μM) nie zaobserwowano istotnego spadku żywotności komórek ludzkich, niezależnie od obecności ABT. To międzygatunkowe zróżnicowanie odpowiedzi toksycznej ma fundamentalne znaczenie dla translacji wyników badań przedklinicznych na człowieka.

Dlaczego plateable hepatocyty są lepsze od tradycyjnych metod?

Tradycyjne zawiesiny hepatocytów, powszechnie stosowane w badaniach przesiewowych metabolizmu, charakteryzują się poważnym ograniczeniem – szybką utratą aktywności enzymatycznej w ciągu 4 godzin. Metody takie jak technika relay (sekwencyjna inkubacja) pozwalają wydłużyć okres obserwacji, ale komplikują rutynowe zastosowanie. W przeciwieństwie do tego, adherentne hepatocyty pierwotne (plateable hepatocytes) utrzymują stabilną funkcję metaboliczną i kompletny profil enzymatyczny przez przedłużony czas hodowli bez sztucznych modyfikacji.

W badaniu plateable hepatocyty wykazały się zdolnością do bezpośredniego wychwytywania reaktywnych metabolitów glutationowych, które w innych systemach wymagają sztucznego dodania kofaktora glutationu. System ten zachował funkcjonalne enzymy cytochromu P450 i precyzyjnie odwzorował metabolizm pośredniczony przez ludzkie enzymy rekombinowane CYP2D6, z głównymi metabolitami wykazującymi porównywalne profile względnej abundancji (M10, M13 i M17).

Dodatkowo, plateable hepatocyty pozwoliły na 72-godzinną inkubację, co umożliwiło identyfikację metabolitów drugorzędowych i produktów reakcji detoksykacyjnych fazy II, które w krótkotrwałych inkubacjach pozostają niewykryte. System ten okazał się szczególnie wartościowy dla oceny związków o niskim klirensie, gdzie długi okres obserwacji jest kluczowy dla uchwycenia pełnego spektrum biotransformacji.

Jakie znaczenie mają te odkrycia dla praktyki klinicznej?

Wykazana wyłączna zależność metabolizmu metoprololu od CYP2D6 ma bezpośrednie implikacje dla bezpieczeństwa farmakoterapii. U pacjentów będących słabymi metabolizerami CYP2D6 (częstość występowania tego polimorfizmu wynosi około 5-10% w populacji kaukaskiej) może dochodzić do istotnego zwiększenia stężeń leku, co niesie ryzyko wzmożonych działań niepożądanych, w tym bradykardii, hipotensji czy zaburzeń przewodnictwa przedsionkowo-komorowego.

Identyfikacja adduktu glutationowego (M7, M14) jako produktu metabolizmu u szczurów, przy jednoczesnym braku istotnej hepatotoksyczności u ludzi w stężeniach terapeutycznych, sugeruje, że obserwowana w badaniach przedklinicznych toksyczność wątrobowa może nie mieć bezpośredniego przełożenia na ryzyko kliniczne. Niemniej jednak, u pacjentów z upośledzoną funkcją wątroby lub otrzymujących jednocześnie inhibitory CYP2D6 (np. chinidyna, fluoksetyna, paroksetyna) zaleca się monitorowanie parametrów wątrobowych.

Badanie dostarcza także cennych danych dla strategii dawkowania opartej na genotypie. U pacjentów z polimorfizmami CYP2D6 zasadne może być rozpoczęcie terapii od niższych dawek metoprololu z późniejszą indywidualną titracją, co pozwoli uniknąć zarówno niewystarczającej skuteczności (u ultra-szybkich metabolizerów), jak i nadmiernej ekspozycji na lek (u słabych metabolizerów).

Jakie są ograniczenia tego badania?

Mimo znaczącego wkładu w zrozumienie metabolizmu metoprololu, badanie posiada pewne ograniczenia. Po pierwsze, wyniki są ograniczone do warunków in vitro – brak bezpośredniej korelacji z efektami klinicznymi wymaga ostrożności w ekstrapolacji wniosków na pacjentów. Chociaż system plateable hepatocytów stanowi zaawansowany model fizjologiczny, nie oddaje on w pełni złożoności metabolizmu in vivo, w tym interakcji między różnymi tkankami i narządami.

Kolejnym ograniczeniem jest niewielka liczba ludzkich dawców hepatocytów (n=1), co może wpływać na uogólnienie wyników na szerszą populację. Zmienność międzyosobnicza w aktywności CYP2D6, wynikająca z polimorfizmów genetycznych, nie została w pełni odzwierciedlona w tym badaniu. Przyszłe badania powinny objąć większą grupę dawców o zróżnicowanym statusie genetycznym CYP2D6, aby lepiej scharakteryzować zakres zmienności metabolicznej.

Wreszcie, badanie nie obejmowało oceny metabolitów in vivo u pacjentów otrzymujących metoprolol w warunkach klinicznych. Bezpośrednie porównanie profili metabolicznych in vitro i in vivo pozwoliłoby na walidację predykcyjnej wartości systemu plateable hepatocytów oraz identyfikację potencjalnych rozbieżności między modelami doświadczalnymi a rzeczywistą farmakoterapią.

Jak te wyniki wpłyną na przyszłe badania metabolizmu leków?

Badanie dostarcza przekonujących dowodów na to, że plateable hepatocyty stanowią solidny system in vitro do badania metabolizmu związków o niskim klirensie. Zidentyfikowanie 22 metabolitów metoprololu, w tym 15 nowych, znacząco poszerza wiedzę o biotransformacji tego powszechnie stosowanego β-blokera. Wykazana wyłączna zależność od CYP2D6 podkreśla konieczność strategii dawkowania opartej na genotypie, szczególnie w populacjach o wysokiej częstości występowania polimorfizmów tego enzymu.

Międzygatunkowe różnice w profilu metabolitów – szczególnie tendencja do tworzenia adduktu glutationowego u szczurów przy jednoczesnym braku istotnej hepatotoksyczności u ludzi – wskazują na ograniczenia w bezpośredniej translacji wyników badań przedklinicznych. System plateable hepatocytów oferuje przewagę nad tradycyjnymi metodami dzięki zdolności do długotrwałej inkubacji i bezpośredniego wychwytywania reaktywnych metabolitów, co czyni go wartościowym narzędziem w ocenie bezpieczeństwa przedklinicznego. Wyniki te mają znaczenie nie tylko dla metoprololu, ale także dla szerszej grupy leków metabolizowanych przez CYP2D6 oraz innych związków o niskim klirensie wymagających szczegółowej charakterystyki metabolicznej.